Analytical recommendations for SARS-CoV-2 identification by RT-PCR in pediatric patients / Recomendaciones analíticas para la identificación de SARS-CoV-2 por RT-PCR en pacientes pediátricos

Abstract Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is caused by the severe acute respiratory syndrome 2 coronavirus (SARS-CoV-2) and is currently listed as a global public health emergency. Timely identification and protocol implementations for molecular detection of this virus are vital for medical decision-making. Identification of SARS-CoV-2 infection cases is based on detection of the virus RNA by molecular tests, particularly real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Technical and operational details specific to each center must be considered to perform the molecular diagnosis of SARS-CoV-2 in pediatric patients. The term “qualified laboratories” involves laboratories in which all users, analysts, and anyone reporting results are trained to develop and interpret results through a procedure implemented previously by an instructor. Such knowledge is essential in detecting and identifying errors during each of its phases: pre-analytical, analytical, and post-analytical, which allow the establishment of continuous improvement policies to ensure the quality of the results, but above all, the physical integrity of health workers.

Resumen La enfermedad por coronavirus de 2019 (COVID-19), causada por el coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave 2 (SARS-CoV-2), está catalogada actualmente como una emergencia de salud pública mundial. La oportuna identificación y la implementación de protocolos para la detección molecular de este virus son de vital importancia para la toma de decisiones médicas. La identificación de los casos de infección por SARS-CoV-2 se basa en la detección de ARN del virus mediante pruebas moleculares, específicamente la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) en tiempo real. Existen detalles particulares de cada centro, tanto técnicos como operacionales, que deben considerarse para llevar a cabo el diagnóstico molecular de SARS-CoV-2 en pacientes pediátricos. El término «laboratorios calificados¼ se refiere a laboratorios en los cuales todos los usuarios, los analistas y cualquier persona que reporta resultados están capacitados para el desarrollo y la interpretación de estos a través de un procedimiento previo implementado por un instructor. Dichos conocimientos son indispensables para la detección y la identificación de errores durante el proceso en cada una de sus fases: preanalítica, analítica y posanalítica. Además, permiten establecer políticas de mejora continua que aseguran la calidad de los resultados, pero sobre todo la integridad física de los trabajadores de la salud.

Saliva as a promising biofluid for SARS-CoV-2 detection during the early stages of infection / La saliva como biofluido promisorio para la detección del SARS-CoV-2 durante las primeras etapas de la infección

Abstract Background: Diagnostic testing for coronavirus disease (COVID)-19 is performed using nasopharyngeal swabs. This type of sampling is uncomfortable for the patient, dangerous for health workers, and its high demand has led to a global shortage of swabs. One of the alternative specimens is saliva. However, the optimal conditions for the test have not been established. Methods: Reverse transcription-polymerase chain reaction was used to detect the viral genome in saliva samples kept at room temperature, in the fridge or frozen for 2 days. In addition, the influence of brushing teeth and feeding on the detection of the virus in saliva was addressed. Finally, the efficiency of saliva in revealing the presence of the virus during the hospitalization period was determined in children. Results: The viral genome was consistently detected regardless of the storage conditions of saliva samples. Brushing teeth and feeding did not influence the sensitivity of the test. In hospitalized children, positive results were obtained only during the early days. Conclusions: These results support the idea of the use of saliva as an alternative specimen for diagnostic testing for COVID-19. The viral genome is stable and endures perturbations in the oral cavity. However, clearance of the virus from the mouth during the infection may limit the use of the test only to the early stages of the disease.

Resumen Introducción: El diagnóstico de COVID-19 (enfermedad por coronavirus 2019) se realiza con un hisopado nasofaríngeo. El procedimiento de toma de muestra es molesto para el paciente y peligroso para el personal de salud, y la alta demanda de análisis ha conducido a la escasez de hisopos. Una alternativa es el uso de saliva, pero las condiciones óptimas para realizar el estudio no han sido establecidas. Métodos: Se usó la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa para detectar el genoma viral en muestras de saliva mantenidas a temperatura ambiente, en refrigeración o congeladas. Además, se evaluó la influencia del aseo bucal y de la ingesta de alimento en la detección del virus. Finalmente, se determinó el desempeño de la saliva para reportar la presencia del virus durante el periodo de hospitalización en niños. Resultados: El genoma viral fue estable durante 2 días a las diferentes temperaturas ensayadas. El aseo bucal y la ingesta de alimento no influyeron en la detección del virus. En los niños hospitalizados solo se obtuvieron resultados positivos durante los primeros días. Conclusiones: Los resultados coinciden con la idea del uso de la saliva como biofluido alternativo para el diagnóstico de COVID-19. El genoma viral es estable y no se ve afectado por perturbaciones en la cavidad oral; sin embargo, la dinámica de la infección puede provocar que el ensayo solo sea útil durante las primeras etapas de la enfermedad.

Expresión atípica en la detección y cuantificación del virus de Epstein-Barr utilizando PCR en tiempo real / Atypic expression in the detection and quantification of Epstein-Barr virus using real-time PCR

Introducción. La carga viral del virus de Epstein-Barr (VEB) no solamente sirve para detectar una infección activa, sino también como marcador tumoral de ciertas formas malignas. En los pacientes inmunocomprometidos está relacionado con el síndrome linfoproliferativo postrasplante (SLPT) y la incidencia se encuentra en el orden de 1 a 20%. Se recomienda la determinación de la carga viral del VEB en sangre total y plasma para dar seguimiento a los pacientes en riesgo de padecer el SLPT; para esto, se utiliza como herramienta la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR-TR). El objetivo de este trabajo es describir los hallazgos de las variaciones identificadas en el genoma del VEB al realizar la detección y cuantificación en muestras de pacientes pediátricos, utilizando la tecnología de PCR-TR. Métodos. Se analizaron retrospectivamente los resultados de 352 pacientes pediátricos a los que se les había realizado la detección y cuantificación del VEB en sangre periférica y plasma por medio de PCR-TR. Se amplificó un fragmento de 166 pb del genoma, utilizando un diseño de la compañía TIB MOLBIOL y el equipo LightCycler®, con una temperatura específica de desnaturalización (Tm) de 68 °C. Resultados. De los 352 pacientes estudiados, se detectó la presencia del VEB en 132 (37.5%) y se cuantificó la carga viral. En 5 de los pacientes positivos (3.8%), se identificó un cambio de la Tm. Por medio de electroforesis en gel de agarosa, se comprobó que el amplificado obtenido corresponde al fragmento de 166 pb. Conclusiones. Consideramos que puede existir una disminución en la concentración de guanina-citosina (G-C) en la secuencia blanco, ya que la Tm sufrió una disminución en todos los casos reportados. Sin embargo, se requiere la secuenciación de los amplificados para determinar con precisión la causa de disminución en la Tm.

Background. Epstein-Barr virus (EBV) viral load is useful not only for detection of an active infection but also as a tumor marker for certain malignant forms. In immunocompromised patients it is related to postransplant lymphoproliferative syndrome (PTLS) with an incidence on the order of 1 to 20%. It is recommended to determine viral load in whole blood and plasma to monitor patients at risk for developing PTLS. Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) is a useful tool for this determination. In these determinations the melting curve (Tm) plays an important role because changes in Tm suggest that the target sequence has suffered mutations, although the selected regions for detection and quantification of EBV are highly conserved. We undertook this study to describe the findings of the variations identified in the EBV genome and to perform the detection and quantification in samples of pediatric patients using RT-PCR. Methods. Results from 352 pediatric patients were analyzed retrospectively in whom investigation of the EBV was performed in peripheral blood and plasma by RT-PCR. For detection and quantification of EBV, a 166-bp fragment of the genome was amplified using a design of TIB MOLBIOL and the LightCycler® equipment with a Tm of 68 °C. Results. Of the 352 patients studied, in 132 (37.5%) presence of EBV was detected and quantified the viral load. In five (3.8%) of the positive patients, a change of the Tm was identified Using electrophoresis running in agarose gel, it was proved that the obtained amplification corresponds to the 166-bp fragment. Conclusion. The specific product and size of the amplified remained unchanged; therefore, we there is a high probability of decrease in the concentration of guanine-cytosine in the target sequence because the Tm showed a decrease in all the reported cases. It is required the sequence of the amplification is required to precisely determine the cause of the decrease in the Tm.

Coexistencia de las mutaciones C677T y A1298C en la enzima 5,10 metilentetrahidrofolato reductasa en pacientes pediátricos con trombosis / Coexistence of C677T and A1298C mutations in the 5,10 methylenetetrahydrofolate reductase enzyme in pediatric patients with thrombosis

Introducción. Una de las alteraciones genéticas que predisponen a trombosis, y que ha sido ampliamente estudiada, es la mutación C677T en el gen que codifica para la enzima 5,10 metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR). Así también, la presencia de la mutación A1298C en el mismo gen es considerada como un factor genético que predispone a trombosis. Métodos. Estudio realizado a 9 pacientes pediátricos con diagnóstico de trombofilia, 7 de sexo masculino y 2 del femenino, con edades de 1 mes a 13 años, a los cuales se les realizó, mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, el estudio de las mutaciones C677T y A1298C en la enzima MTHFR, la mutación G1691A (Leiden) del factor V y la mutación G20210A de la protrombina. Por métodos convencionales se realizó el fenómeno de resistencia a la proteína C activada (RPCa) y las proteínas C y S de la coagulación, así como la antitrombina (AT). Resultados. Todos los pacientes presentaron la coexistencia de las mutaciones C677T y A1298C en la MTHFR; solamente uno de ellos presentó un estado homocigoto para C677T y heterocigoto para A1298C, los otros 8 pacientes presentaron estados heterocigotos para ambas mutaciones; en los 9 pacientes no se demostró la presencia de las mutaciones G1691A del factor V (Leiden) y la G20210A de la protrombina, ni alteraciones en la RPCa, AT y las proteínas C y S de la coagulación. Conclusiones. La coexistencia de las mutaciones C677T y A1298C debe considerarse para su investigación en todos los pacientes que presenten un estado de trombofilia.

Introduction. One of the thrombophilic conditions that has been widely studied is the C677T mutation in the gene encoding the 5,10 methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) enzyme. The presence of mutation A1298C in the same gene is also considered as one factor that predisposes thrombosis. Methods. We report on 9 pediatric patients diagnosed with thrombophilia, 7 males and 2 females with ages ranging from 1 month to 13 years. Real-time polymerase chain reaction was performed along with the study of the C677T and A1298C mutations in the MTHFR enzyme, G1691A mutation (Leiden) and factor V, prothrombin mutation G20210A. Conventional methods were used for activated protein C (APC) resistance and protein C and S coagulation, as well as antithrombin (AT). Results. All patients had coexisting mutations C677T and A1298C in MTHFR. Only 1 patient was homozygous for C6 7 7T and heterozygous for A1298C. The other 8 patients presented heterozygous mutations and in the 9 patients the presence of mutations of G 1691A factor V (Leiden) and G20210A prothrombin was not demonstrated, as well as alterations in APC, AT and proteins C and S. Conclusions. Coexistence of the C677T and A1298C mutations should be considered for investigation in all patients presenting thrombophilia.